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论文分享:只用烧杯、酒精灯、进口水浴锅制备DNA折纸结构

来源:上海沉汇仪器有限公司作者:沉汇网址:http://k2dx28.cn浏览数:22

DNA origami(DNA折纸技术)在分子生物学领域越来越被重视,DNA以其独特的纳米尺度、分子线性结构、物理化学稳定性、力学刚性、自我识别能力以及自组装等优势,正逐步被应用于分子生物学和电子学等领域,也不断成为研究热点。比如在医药领域,DNA纳米结构作为药物载体不仅能减少病毒细胞的耐药性,增强药物对耐药病毒细胞的杀伤作用。并且由于载体的存在,药物在动物体内的循环时间也明显延长,有利于降低给药剂量和减轻毒副作用。

360截图20200428162119626.jpg

很多材料和器件在纳米尺度范围内具有全新的物理性能,当前生命科学的前沿亦必定是纳米或分子水平上的研究,“DNA折纸”的发展,是生命科学领域发展的必经之途。

DNA折纸技术是什么?

DNA脱氧核糖核酸是生物体的生命遗传信息的储存物质。DNA即多个脱氧核苷酸的聚合物,每个核苷酸又由一个脱氧核糖(戊糖)、一个磷酸和一个含氮碱基三部分组成。不同的核苷酸区别在于碱基,有两类碱基:嘌呤类包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G),嘧啶类包括胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。核苷酸之间靠磷酸二酯键连接,即一个核苷酸的5’磷酸基和另一个核苷酸的3’羟基形成共价键,且该键是有方向的。两条DNA单链靠碱基对之间的氢键能够反向结合在一起形成双链,配对的原则是:一条链的A(或T)与另一条链的T(或A)配对,中间含有两个氢键;一条链的C(或G)与另一条链的G(或C)配对,中间含3个氢键。在热力学驱动下,两条互补的单链DNA分子自发杂交,在杂家的过程中,DNA双链通过氢键、范德华力和静电力互相作用,严格遵守Watson-Crick碱基互补配对原则。

BW-10B.jpg

沉汇仪器水浴锅:BW-B系列

2006年,Rothemund首次提出了一种全新的DNA自组装方法——DNA折纸术,利用DNA分子的特殊结构和碱基互补配对规则,将天然DNA长链的特定区域进行折叠,并用短链加以固定,构造出预期的结构。随着研究的不断进行,DNA折纸术结构的尺寸和稳定性得到了明显的改善,DNA折纸术得到的纳米结构可以作为单分子反应的平台,也可作为功能纳米粒子、生物分子、量子点组装的模板。

对于甚多分子生物研究人员来说,DNA origami 结构是研究中必不可少的试验对象。但是现有技术下DNA Origami 的制备非常昂贵,费时而且还处于小作坊制造阶段,产量小,无法大规模制作。制作DNA Origami需要PCR仪,市场上的PCR仪最便宜的两三万,国外大牌子的五万到十万不等,如果不是实验室经费充足,未必会有条件进行相关的研究。

为此,对于DNA origami制备方法的研究在国内外一直在进行。今日沉汇仪器要分享的文章就是Low-cost, simple, andscalable self-assembly of DNA origami nanostructures,本文19年5月在 NanoResearch 上发表,主要讲介绍如何用实验室简单的设备:烧杯、酒精灯、进口水浴锅制备DNA折纸结构。

常规制备DNA折纸结构方法

ExperimentalSection

Molecular self-assembly with scaffolded DNA origami:Structures were designed with the aid of caDNAnov.02. DNA scaffold of   strands of 7560 and 8064 bases derived from the genome of bacteriophage M13 were prepared as described previously. Stapleoligonucleotide strands were prepared by solid-phase chemical synthesis (Eurofins MWG Ebersberg.Germany,HPSF grade). Production of the 42-helix bundle,the six-helix bundle, the Rothemund rectangle and the hexagon-like brick was accomplished in one-pot reaction mixtures.The reaction mixtures contained scaffold strands at a concentration of 50 nm and oligonucleotide strands at 200 nm each.The buffer (pH 8) that was used included Tris (5 mM) EDTA (1 mM).MgCl2 (20 mm) ,and NaCl (5 mm,1x FoB20).The reaction mixtures were subjected to a thermal annealing ramp with use of TETRAD (MJ Research, now Biorad) thermal cycling devices. If not otherwise noted the reaction mixtures were first incubated at 65for 15 min and then cooiled from. 60 to44in steps of 1℃h-1.The reaction products werestored protected from light at 25℃。

01-03 (46-59)Heating Bath-47.jpg

沉汇仪器水浴锅:BW-0510H系列

传统方法中使用PCR仪,不用人工精细控制试验需要的最佳温度和时间,只需要放入机器中,设定好程序解螺旋,退火等就好。

但是有其他研究人员发现,在某个恒定温度下也能高概率的制备出DNA Origami结构,并不需要特别精细的控温和控制时间。在此思路下Low-cost, simple, and scalable self-assembly of DNAorigami nanostructures的作者进行延伸,研究出使用烧杯、酒精灯、水浴锅制备DNA折纸结构的方法。

同时由于不使用PCR仪器,反应容器也不用局限于96微孔板,直接使用500ML的烧瓶,在这篇文章中作者提供了两个制作思路。

360截图20200428163806679.jpg

a几乎不控制温度

将样品放在酒精灯上加热,之后放在一边,缓慢自然降温。这种方法可能只使用对比较robust的结构有用

b较多控制温度

利用可控温的水浴锅,在加热之后样品后将其放入温度恒定的水浴锅中持续退火,然后再进行冷却。

具体试验方法如下:自然退火法

1、mixing up to 25 ml of folding solution with 5 mM Tris,5 mM NaCl, 1 mM EDTA. 20 mM MgCI2,20 40nM of the ssDNA scaffold strand, and 100 nM of each staple strand in a 50mLglass flask.

混合所有原料

2、The flask was heated on a hot plate until solution the solution reached 65-70℃ and held at that temperature for 15 min

加热至65-70度,恒温15min

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3、With 20 mL of solution in a 50 mL flask in a covered Styrofoam cooler packed with Styrofoam pellets,cooling from 65 to room temperature took less than 60 min

在泡沫箱里冷却至室温,整个过程大约持续60min

Notice:The flask was vented occasionally approximately every 3-4 min. to relieve pressure build-upas the flask was cooling

注意时不时要给烧瓶放压

水浴法

1、mixing up to 75mL of folding solution with 5 mM Trnis,5 mM NaCl.1 mM EDTA,20 mM MgCl 2,2040nM of the ssDNAscaffold strand. and 100 nM

of each staplestrand ina 50 ml glass flask

混合所有原料

2、The flask containing the reaction was again heated on hot plate until solution is 65-70℃ and held in this range for 15 min.

将所有混合的原料混合后在加热板上加热至65-70,并保持恒温15min

3、flask as placed in waterbath pre-heated to the desired temperature, for 1-4h.

之后将加热的溶液放入恒温水浴锅中,设置好预定的温度,保持水浴1-4小时。(在水浴过程中需防止水分蒸干)

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(沉汇仪器水浴锅系列)

4、冰浴10分钟

干锅法:

The butane burner asturned on and the height of the ring stand and the gas fiow of the burer was adjusted to reach the desired temperatures (65 70℃ for melting phase and 51-56℃ for annealing

恒温过程改为调整火焰大小和放置烧杯的铁架合距离火焰的高度来达到所需温度。

实验结果显示,这两种方法下,扩大体系对DNA折叠结构形成没有影响。

360截图20200428163644034.jpg

但是从实验结果上来看,这一方法对于制备并没有技术性突破,由于不再使用PCR仪,加热,退火等步骤需要靠人监控来判断合适的时间,这将大大增加人工负担。虽然大规模反应容器的采用能提高产出规模,但是DNA表征还是需要靠琼脂糖凝胶电泳来实现。这个设备并不比PCR仪便宜。能用的起琼脂糖凝胶电泳的实验室也是买的起PCR仪的,对于这些实验室来讲,这种抛弃省力的PCR仪器,采用耗时的人工,无疑是反裘负薪,买椟还珠了。

当然这也为今后大规模,便捷,低廉的发展做出了很好的尝试,为试验人员开辟了新的思路。

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